Термостабильная ДНК-полимераза ⇐ Васина Википедия

[wiki_en]

«Термостабильные ДНК-полимеразы» представляют собой ДНК-полимеразы, которые происходят от термофилов, обычно видов бактерий или архей, и поэтому являются термостабильными. Они используются для полимеразной цепной реакции и связанных с ней методов амплификации и модификации ДНК.

== Бактериальные полимеразы ==
Термостабильные ДНК-полимеразы природного происхождения обнаружены у термофильных бактерий, архей и их возбудителей. Среди бактериальных термостабильных ДНК-полимераз используются Taq-полимераза, Tfl-полимераза, Tma-полимераза, Tne-полимераза и Tth-полимераза.J. Клайн, Дж. К. Браман, Х. Х. Хогрефе: «Точность ПЦР ДНК-полимеразы БОЕ и других термостабильных ДНК-полимераз». В: «Nucleic Acids Res.», том 24, выпуск 18, 1996, стр. 3546–3551. ПМИД 8836181;
В дополнение к 5'→3'-полимеразной активности бактериальные термостабильные ДНК-полимеразы (принадлежащие к ДНК-полимеразам А-типа) обладают 5'→3'-экзонуклеазной активностью и генерируют аденозиновый выступ (липкие концы) на 3'-конце. вновь образованная прядь. Процессивность описывает среднее количество пар оснований до того, как полимераза оторвется от матрицы ДНК. Процессивность используемой полимеразы ограничивает максимальное расстояние между праймером и зондом при количественной ПЦР в реальном времени (кПЦР). Процессивность Taq-полимеразы составляет около 200 пар оснований.

== Архейные полимеразы ==
Часто используемыми ДНК-полимеразами B-типа являются полимераза Pfu, полимераза Pwo, полимераза KOD, M. Такаги, М. Нисиока, Х. Какихара, М. Китабаяши, Х. Иноуэ, Б. Каваками, М. Ока, Т. Иманака: «Характеристика ДНК-полимеразы Pyrococcus sp. штамм KOD1 и его применение в ПЦР». В: «Appl. Окружающая среда. Микробиол.», том 63, выпуск 11, 1997, с. 4504–4510. ПМИД 9361436;
Архейные варианты (относящиеся к В-типу) дают тупые концы (полимераза Tli дает выступ примерно в 30 % продуктов) и вместо 5'→3' экзонуклеазной активности обладают активностью по исправлению ошибок синтеза (доказательство- чтение), активность экзонуклеазы 3'→5'.E. М. Кеннеди, К. Херготт, с. Дьюхерст, Б. Ким: Механистическая архитектура термостабильного мотива ДНК-полимеразы A Pyrococcus Furiosus семейства B и его взаимодействие с субстратом dNTP. В: «Биохимия» (2009), том 48(47), с. 11161–8. ПМИД 19817489;
== Модифицированные полимеразы ==
Различные слитые белки с низкой частотой ошибок архей и высокой скоростью синтеза бактериальных термостабильных ДНК-полимераз (полимеразы Q5) были созданы из различных термостабильных полимераз и ДНК-зажима термостабильного ДНК-связывающего белка SSo7d с помощью белкового дизайна.Y . Ван, Д.Э. Просен, Л. Мей, Дж. К. Салливан, М. Финни, П. Б. Вандер Хорн: новая стратегия разработки ДНК-полимераз для повышения процессивности и улучшения производительности in vitro. В: «Nucleic Acids Res.» (2004), том 32(3), с. 1197–207. ПМИД 14973201;
Были сравнены базовые скорости синтеза различных полимераз (процессивность, продуктивность). Скорость синтеза Taq-полимеразы составляет около 60 пар оснований в секунду. Среди немодифицированных термостабильных ДНК-полимераз только скорость синтеза KOD-полимеразы превышает 100 пар оснований в секунду (около 120 пар оснований в секунду).Европейский патент 1752534A1: «Hochgeschwindigkeits-PCR unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-DNA-Polymerase». '', 12 мая 2005 г. / 14 февраля 2007 г., Тойо Босеки (заявитель) и Масая Сегава и др. (изобретатели). Среди модифицированных термостабильных ДНК-полимераз были описаны различные мутации, которые увеличивают скорость синтеза.Патент США 2013034879A1: «ДНК-полимеразы», ​​02.08.2012/02.07.2007 14, Fermentas UAB et al (заявитель), Ремигиюс Скиргайла и др. (изобретатели).Патент США 2009280539A1: «ДНК-полимеразы и родственные методы», 16 апреля 2009 г. / 12 ноября 2009 г., Roche Molecular Systems Inc (заявитель), Кейт А. Бауэр ( изобретатель). Полимераза KOD и некоторые модифицированные термостабильные ДНК-полимеразы (iProof, Pfu Ultra, Phusion, Velocity или Z-Taq) используются в качестве варианта ПЦР с более короткими циклами амплификации (быстрая ПЦР, высокоскоростная ПЦР) из-за их высокая скорость синтеза.

Частота ошибок различных полимераз (верность) известна и описана. Частота ошибок Taq-полимеразы составляет 8–10-6 ошибок на пару оснований, у KOD-полимеразы 3,5 – 10-6 ошибок на пару оснований, у Tli-полимеразы и Геркулаза 2,8–10-6 ошибок на пару оснований, Pfu-полимераза 1,3 – 10-6 ошибок на пару оснований и Pfu Ultra 4,3 – 10- 7 ошибок на пару оснований.

В бактериальных термостабильных ДНК-полимеразах фрагмент Кленова (Klen-Taq) или фрагмент Стоффеля может быть получен путем удаления экзонуклеазного домена в ходе конструирования белка, аналогично ДНК-полимеразе из ''E. coli'', что приводит к более высокой концентрации продукта.W. М. Барнс: «Точность Taq-полимеразы, катализирующей ПЦР, повышается за счет делеции N-конца». В: Джин (1992), том 112 (1), с. 29–35. PMID 1551596. Две аминокислоты, необходимые для экзонуклеазной функции Taq-полимеразы, были идентифицированы методом мутагенеза как аргинины в положениях 25 и 74 (R25 и R74).L. п. Меркенс, с. К. Брайан, Р. Э. Мозес: «Инактивация 5'-3» экзонуклеазы ДНК-полимеразы Thermus aquaticus». В: «Biochim Biophys Acta» (1995), том 1264 (2), с. 243–8. PMID 7495870.

Предпочтение отдельных нуклеотидов термостабильной ДНК-полимеразой называется нуклеотидной специфичностью (смещенностью). При секвенировании ДНК на основе ПЦР с субстратами обрыва цепи (дидезокси-метод) часто желательно их равномерное включение и, следовательно, равномерное образование всех продуктов обрыва цепи, чтобы обеспечить более высокую чувствительность и упростить анализ. Для этой цели путем делеции была создана полимераза KlenTaq, а фенилаланин в положении 667 был заменен на тирозин с помощью сайт-направленного мутагенеза (сокращенно: F667Y) и назван термосеквеназой.p. Табор, К.С. Ричардсон: «Один остаток в ДНК-полимеразах семейства ДНК-полимераз I Escherichia coli имеет решающее значение для различения дезокси- и дидезоксирибонуклеотидов». В: «Proc Natl Acad Sci U S A.», Том 92, Выпуск 14, 1995 г., с. 6339–6343. ПМИД 7603992;
== Другие ДНК-полимеразы ==
ДНК-полимеразы, используемые при изотермической амплификации ДНК, например при мультисмещенной амплификации, амплификации рекомбиназной полимеразы или изотермической сборке для амплификации целых геномов (например, ДНК-полимераза φ29 ​​из бактериофага phi29) не являются термостабильными. ДНК-полимеразы Т4, Т6 и Т7 также не являются термостабильными.

== Приложения ==
Помимо выбора термостабильной ДНК-полимеразы, в ходе ПЦР-оптимизации целенаправленно изменяются и другие параметры ПЦР.

Помимо ПЦР, термостабильные ДНК-полимеразы также используются для вариантов ОТ-ПЦР, кПЦР в различных вариантах, сайт-специфического мутагенеза и секвенирования ДНК. Их также используют для производства зондов гибридизации для Саузерн-блоттинга и Нозерн-блоттинга путем случайного прайминга. Активность экзонуклеазы 5'→3' используется, среди прочего, для ник-трансляции и TaqMan без репликации ДНК (амплификации).

== Литература ==
* Джозеф Сэмбрук | Дж. Сэмбрук, Т. Маниатис, Д. В. Рассел: «Молекулярное клонирование: лабораторное руководство». Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор; 3-е издание (2001 г.), ISBN 0-87969-577-3.

* [http://www.promega.com/~/media/Files/Re ... erases.pdf Promega: Свойства термостабильных ДНК-полимераз] (PDF; 208 kB) . По состоянию на 27 сентября 2012 г.
* [http://polbase.neb.com/references/3648 НЭБ Polbase]. По состоянию на 27 сентября 2012 г.
* [http://www.fermentas.com/en/products/al ... olymerases Fermentas DNA-Polymerasen]. По состоянию на 27 сентября 2012 г.

Биохимия
Молекулярная биология
Полимеразная цепная реакция

Подробнее: https://en.wikipedia.org/wiki/Thermosta ... Polymerase