USER fusion (специфичный реагент для удаления урацила) ⇐ Васина Википедия

[wiki_de]

Клонирование урацил-специфическим эксцизионным реагентом (USER) — это удобная для пользователя стратегия клонирования, которая позволяет клонировать до нескольких фрагментов ДНК в определенных положениях вектора за один этап. Таким образом, эта стратегия клонирования превосходит классическое клонирование на основе ферментов рестрикции и лигазы с точки зрения скорости, эффективности и простоты.

Этот метод основан на праймерах со специфичными для вектора выступами, которые содержат одно дезоксиуридиновое основание (урацил), которое используется для амплификации желаемого фрагмента ДНК в реакции ПЦР. Затем ПЦР-фрагмент обрабатывают смесью ферментов USER (урацил-ДНК-гликозилаза и ДНК-гликозилаза-лиаза Endo VIII) с образованием уникальных 3'-концевых концов, которые комплементарны 5'-кончикам, присутствующим в векторе.
Чтобы иметь возможность формировать в векторе дополнительные выступы, он должен содержать кассету USER. Примером кассеты USER является сайт рестрикции PacI, окруженный двумя сайтами разрыва Nt.BbvCI. При добавлении фермента рестрикции PacI происходит двухцепочечный разрыв, который с последующим высвобождением 7 оснований Nt.BbvCI ниже сайта PacI образует 5'-выступающий конец вектора длиной 9 пар оснований (рис. 1B). Для того чтобы произошло спаривание оснований, этот выступ должен быть комплементарен выступу, образовавшемуся в ПЦР-фрагменте. Спаривание оснований между 9 комплементарными основаниями достаточно стабильно, чтобы трансформировать вектор со вставленным фрагментом в E. coli, где плазмида лигируется вместе с помощью собственной системы репарации ДНК организма.


Подробнее: https://de.wikipedia.org/wiki/USER_fusi ... n_Reagent)